微生物分离方法

想明白这个问题，先要了解固体培养基分离都有哪些方法：1.1稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。1.2涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1）。图1涂布平板法1.3平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线（图2），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。图2平板划线法1.4稀释摇管法用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡－－石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。这四种方法都用其不同用途，但是涂布和划线经常要一起做才能确保，我个人意见是涂布容易再污染，并且遇到未知样时，往往不知道其菌含量大小，菌含量大的是涂布出来的，而且涂布需要准备的平板数大于划线，划线要求技术熟练，简单再污染几率小于涂布，但是往往要做很多才能得到，时间太长

自己去找乳糖是还原性糖吗 还原性糖种类：还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等。 非还原性糖有蔗糖、淀粉、纤维素等，但它们都可以通过水解生成相应的还原性单糖。 还原性糖概念：还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。 葡萄糖分子中含有游离醛基，果糖分子中含有游离酮基，乳糖和麦芽糖分子中含有游离的醛基，故它们都是还原糖。 还原性糖鉴定： 鉴定原理：生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基）。用斐林试剂、班氏试剂、银氨溶液等可以检验生物组织中还原糖存在与否。 （1）利用斐林试剂：斐林试剂由质量浓度为0.1g／mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05g／mL的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的Cu2O沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。其反应式如下： CH2OH—(CHOH)4—CHO＋2Cu(OH)2→CH2OH—(CHOH)4—COOH＋Cu2O↓＋2H2O 用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→→棕色→砖红色(沉淀)。 (2)利用班氏试剂：班氏试剂由A液(硫酸铜溶液)，B液(柠檬酸钠和碳酸溶液)配制而成。将A溶液倾注人B液中，边加边搅，如有沉淀可过滤。实验原理与斐林试剂相似，所不同的是班氏试剂可长期使用。班氏试剂A液中的硫酸铜溶液与B液中的无水硫酸钠和柠檬酸钠相遇，能产生可溶性的又略能离解出cu2+的柠檬酸铜。 (3)利用银氨溶液：银氨溶液是在2％的AgNO3溶液中逐滴滴人2％的稀氨水，至最初产生的沉淀恰好溶解为止，这时得到的溶液就是银氨溶液。银氨溶液中含有Ag(NH3) 20H(氢氧化二氨合银)，这是一种弱氧化剂，能把醛基氧化成羧基，同时Ag+被还原成金属银。还原生成的银附着在试管壁上，形成银镜。可见，银镜反应也可用于鉴定可溶性还原糖。鉴定的结果是出现银镜。 用班氏试剂鉴定可溶性还原糖，比用斐林试剂更简便 斐林试剂要现配现用，否则实验难以得到满意结果，因为此反应利用的是斐林试剂中的Cu(OH) 2产物作为弱氧化剂参与与还原糖的反应，而我们知道，Cu(OH) 2是一种沉淀物质，放置过久沉淀过多则不利于反应，而班氏试剂是斐林试剂的改良，它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，使溶液稳定、灵敏度高且可以长期使用，故更简便。 班氏试剂与斐林试剂比较 首先，两者的配方不一样。斐林试剂主要由质量浓度为0.1g•mL-1的NaOH溶液和质量浓度为0.05g•mL-1的CuSO2溶液配制而成。其中0.1gmL-1的NaOH溶液称为斐林试剂甲，0.05g•mL-1的CuSO4溶液称为斐林试剂乙。而班氏试剂的配方为：①400mL水中加85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠；②50mL加热的水中加入8.5g无水硫酸铜，制成CuSO4溶液；③把CuSO2溶液倒入柠檬酸钠�Na2CO3溶液中，边加边搅，如产生沉淀可滤去。 ��其次，两者在反应原理上略有差别。利用斐林试剂鉴定时，斐林试剂甲和斐林试剂乙直接反应产生Cu（OH）2，Cu（OH）2和可溶性还原糖反应产生砖红色沉淀。而班氏试剂中Cu（OH）2的产生却是这样的：柠檬酸钠和碳酸钠均为强碱弱酸盐，在水中它们均可水解产生OH-，与柠檬酸钠�Na2CO3溶液和CuSO4溶液混合时，Cu2+和OH-结合，生成Cu（OH）2，Cu（OH）2与葡萄糖中的醛基反应产生砖红色沉淀。 高浓度食盐：可以分离金黄色葡萄球菌 青霉素：杀死细菌，分离出真菌 无氮培养基：分离出圆褐固氮菌

一般有以下五种方法：1、倾注平板法 首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。2、涂布平板法 首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。3、平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。4、富集培养法 富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。5、厌氧法 在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。

想明白这个问题，先要了解固体培养基分离都有哪些方法： 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1）。 图1 涂布平板法 1.3 平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线（图2），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 图2 平板划线法 1.4 稀释摇管法 用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡－－石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。     这四种方法都用其不同用途，但是涂布和划线经常要一起做才能确保，我个人意见是涂布容易再污染，并且遇到未知样时，往往不知道其菌含量大小，菌含量大的是涂布出来的，而且涂布需要准备的平板数大于划线，划线要求技术熟练，简单再污染几率小于涂布，但是往往要做很多才能得到，时间太长

乳糖是还原性糖吗还原性糖种类：还原性糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等。非还原性糖有蔗糖、淀粉、纤维素等，但它们都可以通过水解生成相应的还原性单糖。 还原性糖概念：还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。葡萄糖分子中含有游离醛基，果糖分子中含有游离酮基，乳糖和麦芽糖分子中含有游离的醛基，故它们都是还原糖。 还原性糖鉴定： 鉴定原理：生物组织中普遍存在的还原糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖。它们的分子内都含有还原性基团（游离醛基或游离酮基）。用斐林试剂、班氏试剂、银氨溶液等可以检验生物组织中还原糖存在与否。 （1）利用斐林试剂：斐林试剂由质量浓度为0.1g／mL的氢氧化钠溶液和质量浓度为0.05g／mL的硫酸铜溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2与加入的葡萄糖在加热的条件下，能够生成砖红色的Cu2O沉淀，而葡萄糖本身则氧化成葡萄糖酸。其反应式如下：CH2OH—(CHOH)4—CHO＋2Cu(OH)2→CH2OH—(CHOH)4—COOH＋Cu2O↓＋2H2O用斐林试剂鉴定还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→→棕色→砖红色(沉淀)。 (2)利用班氏试剂：班氏试剂由A液(硫酸铜溶液)，B液(柠檬酸钠和碳酸溶液)配制而成。将A溶液倾注人B液中，边加边搅，如有沉淀可过滤。实验原理与斐林试剂相似，所不同的是班氏试剂可长期使用。班氏试剂A液中的硫酸铜溶液与B液中的无水硫酸钠和柠檬酸钠相遇，能产生可溶性的又略能离解出cu2+的柠檬酸铜。 (3)利用银氨溶液：银氨溶液是在2％的AgNO3溶液中逐滴滴人2％的稀氨水，至最初产生的沉淀恰好溶解为止，这时得到的溶液就是银氨溶液。银氨溶液中含有Ag(NH3) 20H(氢氧化二氨合银)，这是一种弱氧化剂，能把醛基氧化成羧基，同时Ag+被还原成金属银。还原生成的银附着在试管壁上，形成银镜。可见，银镜反应也可用于鉴定可溶性还原糖。鉴定的结果是出现银镜。 用班氏试剂鉴定可溶性还原糖，比用斐林试剂更简便斐林试剂要现配现用，否则实验难以得到满意结果，因为此反应利用的是斐林试剂中的Cu(OH) 2产物作为弱氧化剂参与与还原糖的反应，而我们知道，Cu(OH) 2是一种沉淀物质，放置过久沉淀过多则不利于反应，而班氏试剂是斐林试剂的改良，它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，使溶液稳定、灵敏度高且可以长期使用，故更简便。 班氏试剂与斐林试剂比较 首先，两者的配方不一样。斐林试剂主要由质量浓度为0.1g•mL-1的NaOH溶液和质量浓度为0.05g•mL-1的CuSO2溶液配制而成。其中0.1gmL-1的NaOH溶液称为斐林试剂甲，0.05g•mL-1的CuSO4溶液称为斐林试剂乙。而班氏试剂的配方为：①400mL水中加85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠；②50mL加热的水中加入8.5g无水硫酸铜，制成CuSO4溶液；③把CuSO2溶液倒入柠檬酸钠�Na2CO3溶液中，边加边搅，如产生沉淀可滤去。��其次，两者在反应原理上略有差别。利用斐林试剂鉴定时，斐林试剂甲和斐林试剂乙直接反应产生Cu（OH）2，Cu（OH）2和可溶性还原糖反应产生砖红色沉淀。而班氏试剂中Cu（OH）2的产生却是这样的：柠檬酸钠和碳酸钠均为强碱弱酸盐，在水中它们均可水解产生OH-，与柠檬酸钠�Na2CO3溶液和CuSO4溶液混合时，Cu2+和OH-结合，生成Cu（OH）2，Cu（OH）2与葡萄糖中的醛基反应产生砖红色沉淀。